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Haemophilus

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1. morphologie classification et habitat

C'est Haemophilus influenzae qui a été la première bactérie de ce genre à être décrite : elle fut isolée du tractus respiratoire et l'on cru qu'elle était responsable de la grippe d'où le mot influenzae.

Haemophilus dans un LCR (méningite)

La culture de ces bactéries nécessite du sang : Haemophilus = qui aime le sang. Elle est toutefois faible sur gélose au sang frais.

Les Haemophilus sont des symbiotes (parasites) obligatoires des muqueuses (tractus respiratoire, bouche, vagin, intestin) possédant une grande spécificité d'hôte. H. influenzae est surtout rencontré au niveau respiratoire. Il peut tout de même être trouvé dans les selles et au niveau vaginal ce qu'il n'est pas facile de démontrer techniquement vu l'importance des flores associées.

La spécificité d'habitat est d'ailleurs parfois liée aux biotypes.

La grande caractéristique des Haemophilus est leur exigence en un ou deux facteurs de croissance généralement absent des milieux usuels (même riches) :

• le facteur V ou NAD-NADP et/ou
• le facteur X ou hémine (protoporphyrine + Fer II)

Les Haemophilus importants sont en pathologie médicale :

• influenzae (besoin en NAD et hémine)
• parainfluenzae (besoin en NAD, pas de besoin en hémine)
• ducreyii : agent de MST, le chancre mou, que l'on ne rencontrera que très rarement avec peu de chances de culture tant celle ci est fastidieuse et peu productive. Ce dernier devrait être rapidement déclassé dans un nouveau genre car il n'a rien à voir avec les Haemophilus. (4 % d'homologie DNA-DNA)

Plus globalement, on rassemble Haemophilus, Pasteurella et Actinobacillus dans la famille des Pasteurellaceae sur la base d'hybridations DNA-DNA. Il est probable que de profonds remaniements surviendront, l'exigence en facteurs de croissance ne pouvant être une méthode taxonomique fiable. Des bactéries actuellement classées dans d'autres genres se verront incluses dans les Haemophilus sans pour autant avoir des besoins en NAD et hémine et inversement... Il existe d'ailleurs déjà des Haemophilus non exigeants en NAD et/ou hémine.

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2. pouvoir pathogène

• H. influenzae est un hôte fréquent de la muqueuse respiratoire. Il est un pathogène occasionnel (opportuniste) fréquent des voies respiratoires et parfois en cause dans les méningites. C'est surtout le sérotype b capsulé qui est en cause appartenant au biotype 1.
  Formule de la capsule : -(bDRibose-(1Æ1)-D-Ribitol-5-Phosphate )- ou PRP.
  
• Haemophilus parainfluenzae, opportuniste, peut être en cause dans des infections respiratoires.
  
• Haemophilus ducreyii est responsable du chancre mou (chancre local et adénopathie correspondante), Maladie sexuellement transmissible (MST).

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3. isolement

L'isolement d'Haemophilus a nécessité la fabrication de nouveaux milieux. Il cultive en effet très mal sur gélose au sang frais. On lui préfèrera la gélose au sang cuit ou la gélose chocolat supplémentée (ou enrichie) : les colonies minuscules sur GS deviennent souvent luxuriantes sur gélose Chocolat enichie.

La gélose au sang cuit est une gélose de base riche (Columbia), additionnée de 5 % de sang et chauffée 10 minutes à 75°C. La cuisson élimine certains inhibiteurs, en particulier la NAD hydrolase du plasma et libère le NAD, le fer et l'hémine de l'hématie.

On préfère la gélose Chocolat enrichie qui a une composition plus régulière. C'est une base type Columbia ou Mueller Hinton additionnée d'hémoglobine, base autoclavée. Elle est éventuellement supplémentée d'un mélange glucosé, ionisé et polyfacteurs de croissance lyophilisé et stérile, lorsqu'elle est en surfusion.

Ce mélange commercialisé (Polyvitex Mérieux par ex.), souvent appelé mélange vitaminique alors qu'il contient du glucose et des ions minéraux, contient :

• Glucose
• Ions minéraux (nitrate de fer III)
• Acides aminés (glutamine, cystéine, cystine)
• Bases azotées (Adénine-Guanine)
• Coenzymes (PAB, NAD, TPP)

Une incubation sous dioxyde de carbone est parfois préférable.

Il peut être rendu sélectif par bacitracine (300 mg/L) ou vancomycine, bacitracine et clindamycine.

Il ne peut être observé d'hémolyse en gélose Chocolat supplémentée puisqu'il n'y a pas d'hématies. Un éclaircissement apparait souvent avec les Streptococcus sous l'action possible de peroxydases ?

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4. identification

Elle repose sur la mise en évidence des besoins en facteurs NAD et hémine.

Deux grandes techniques permettent la mise en évidence :

• disques : La culture est réalisée sur gélose ordinaire riche (Trypticase soja ou Columbia ou Mueller Hinton), inondée de la culture de l'Haaemophilus puis des disques d'hémine et de NAD sont déposés. On compare les cultures autour des disques pour conclure.

  

à gauche : besoin en X+V (Hémine + NAD) H. influenzae

à droite : besoin en NAD (V) H. parainfluenzae

(extrait du Dictionnaire des techniques du CRDP de Bordeaux)

• cultures comparées en Chocolat, Chocolat supplémentée, Trypticase soja, Trypticase soja supplémenté. Le supplément utilisé peut être le Polyvitex. La gélose Chocolat contient évidemment l'hémine.

  

• Remarque : on peut aussi utiliser la culture en association avec une souche productrice de NAD dans le milieu comme Staphylococcus aureus ou Enterococcus faecalis. Ce constat peut aussi être fait lors de l'isolement. Comme pour les disques on observe la culture de l'Haemophilus autour des souches.

  
  (extrait du Dictionnaire des techniques du CRDP de Bordeaux)

Cette dernière technique peut être réalisée sur la Gélose Chocolat (SANS polyvitex) : Haemophilus influenzae va alors cultiver autour de la strie et Haemophilus parainfluenzae de même.
La photographie ci-dessous le montre : remarquer le dégradé de culture au fur et à mesure que l'on s'éloigne de la strie de Staphylococcus, donc la concentration en NAD.

L'identification précise utilise :

• théoriquement l'oxydase : elle s'avère le plus souvent négative (la littérature la donne positive) avec les souches utilisées dans les lycées provenant de l'Institut Pasteur... et positive avec des souches hospitalières !
• une galerie API20E ensemencée avec suspension en hémine et NAD.
• ou de préférence des galeries spécialisées, souvent communes avec les Neisseria, comme la galerie API NH (voir Documentation technique du CRDP de Bordeaux).

Notes sur la galerie API20NH :

Elle est prévue pour être lue en DEUX heures. Elle inclue :

un test chromogénique de recherche de bétalactamase (bleu -, jaune et variations sur jaune : +).

l'étude de diverses fermentations (GLU, FRU, MAL, SAC)

ODC et l'Uréase

trois cupules permettant 6 recherches :

directement

LIPase (incolore -, bleu +)

PAL (phosphatase alcaline) (incolore -, jaune +)

bGAL (BétaGalactosidase) (incolore -, jaune +)

indirectement après addition d'un réactif (Zym B)

dans la cupule LIP : ProA Proline aminopeptidase (jaune -, orange +; brun si LIP+)

dans la cupule PAL : GGT (Gammaglutamyl transférase) (jaune -, orange +; jaune-orange si PAL+)

indirectement après addition d'un réactif de recherche de l'indole (James par exemple)

dans la cupule bGAL : Indole (incolore -, rose +)

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5. traitement et antibiogramme

L'antibiogramme pose problème particulier au vu des exigences de culture. On doit utiliser une gélose supplémentée : Chocolat supplémentée ou MH additionné d'extrait globulaire ou des mélanges de facteurs de croissance (milieu HTM pour Haemophilus Test Medium, Mueller Hinton additionné de NAD, hémine et extrait de levure).

Les Haemophilus sont résistants aux lincosamines et peu sensibles aux macrolides.

Il existe des résistances et des multirésistances chez certaines souches (10 à 15 % des souches en France).

La béta-lactamase doit être recherchée et dès l'isolement car elle est constitutive (par exemple test Cefinase®).

Antibiogramme d'Haemophilus influenzae sur gélose Chocolat supplémentée Test Cefinase positif

Les antibiotiques utilisés sont normalement l'ampicilline et le chloramphénicol, mais la grande fréquence des résistances (40%) conduit à conseiller une céphalosporine de 3^ème génération (céfotaxime) dans le cas des méningites et de l'association de type Amoxicilline + Acide clavulanique pour les infections respiratoires.

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6. prophylaxie

Elle repose esentiellement sur un vaccin contre Haemophilus influenzae b, constitué du polyoside capsulaire lié à une protéine, généralement une anatoxine diphtérique ou tétanique.

L'introduction de ce vaccin (France 1992) a provoqué une chute des méningites à Haemophilus influenzae que l'on peut mesurer par l'incidence chez les enfants de 0 à 1 an en France :

• 1992 : 33,6 pour 100 000
• 1996 : 2,2 pour 100 000

compléments

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un cas surprenant :

Bactériémie à Haemophilus influenzae non sérotypable à point de départ génital chez une femme enceinte

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P. Imbert (hiabegin.mit@woridonline.tr), C. Rapp, J.M. Dot, T. Debord, R. Roué
Service des maladies infectieuses et tropicales, hôpital d'instruction des armées Bégin, 69, avenue de Paris, 94160 Saint-Mandé, France
(Médecine et maladies infectieuses 2001; 31 ; 723,724
bactériémie / grossesse / Haemophilus influenzae
bacteremIa / Haemophilus influenzae/ pregnancy

Les bactériémies à Haemophilus influenzae sont rares, représentant 0,1 à 1% des bactériémies de 1'adulte [1]. Le point de départ en est le plus souvent pulmonaire ou ORL, en relation avec des souches encapsulées biotype I sérotype b. Dans 5 à 10 % des cas, elles sont d'origine gynéco-obstétricale en rapport avec des formes non capsulées pourtant réputées peu invasives. Nous en rapportons un nouveau cas chez une femme enceinte immunocompétente.

CAS CLINIQUE

Madame E.B., âgée de 29 ans, mère de deux enfants originaire du Cap-Vert, sans pathologie connue ni contraception, était admise le 11 mai 1999 pour des métrorragies fébriles avec frissons apparues la veille et précédées depuis six jours de brûlures mictionnelles, de pollakiurie et de lombalgies. À l'admission, l'examen clinique était normal en dehors d'une fièvre à 39°C et d'un état général altéré sans modification hémodynamique. L'échographie pelvienne révélait une grossesse monochoriale de 12 semaines. Les radiographies du thorax et des sinus étaient normales. Les examens biologiques montraient une leucocytose à 14400/mm3 (13 000 neutrophiles) et une CRP à 107 mg/L. L'examen cytobactériologique des urines était normal, mais le prélèvement vaginal et trois hémocultures révélaient la présence de H. influenzae biotype II non sérotypable sensible à l'amoxicilline (Centre National de Référence, Pr Dabernat). Les sérologies de la listériose et du VIH étaient négatives. Malgré le céfotaxime IV 3 g/j débuté dès l'admission, les métrorragies s'aggravaient jusqu'à l'expulsion du fœtus, motivant une révision utérine le 12 mai. Le liquide d'aspiration utérine s'avérait stérile, mais l'histologie du placenta confirmait l'existence d'une placentite. L'évolution ultérieure était rapidement favorable avec apyrexie dès le 13 mai, autorisant le 14 mai un relais par amoxicilline-acide clavulanique per os 3 g/j pendant 15 jours, et la sortie le 21 mai.

COMMENTAIRES

Classiquement les souches non capsulées sont responsables d'infections essentiellement locales, bronchopulmonaires et ORL surtout [ 1]. En fait les bactériémies à H. innfluenzae non capsulées de l'adulte sont devenues majoritaires depuis la raréfaction des infections à souches capsulées liée à la vaccination anti-haemophilus [2], sans augmentation globale de l'incidence ou de la gravité de ces infections [2, 3]. Leur origine est surtout pulmonaire, puis ORL. Une immunodépression est alors fréquemment retrouvée [1, 3].

Une porte d'entrée gynéco-obstétricale est présente dans 5 à 10 % des cas[1]:
- en dehors de la grossesse, I'incidence annuelle des infections à H. influenzae non sérotypables, endométrites et/ou salpingites, est en augmentation. Le rôle favorisant d'un dispositif intra-utérin et des rapports bucco-génitaux est évoqué par certains auteurs [1]. La prédominance du biotype IV, soulignée par certains [4], est contestée par d'autres auteurs [5];
- chez les femmes enceintes, la prévalence de ces infections est six fois plus élevée que chez les femmes du même âge non gravides [1]. Les aspects cliniques et bactériologiques varient selon le stade de la grossesse [1, 4]: avortement fébrile en début de grossesse (biotype II ++), chorioamniotite près du terme, volontiers suivie d'une rupture prématurée des membranes (biotype IV ++), endométrite en post-partum surtout après une césarienne ou une rupture prématurée des membranes. Une colonisation génitale existe dans 1 à 2% des grossesses seulement, mais elle entraîne une infection néonatale dans 50 % des cas même en l'absence de symptômes chez la mère [1, 5, 6].
Chez la femme enceinte, les bactériémies à H. influenzae ont une origine essentiellement génitale, sauf chez les toxicomanes [1, 4]. Elles surviennent surtout aux périodes extrêmes de la grossesse, et ont un pronostic sévère chez la mère [1] et surtout chez l'enfant: mort in utero, prématurité, infection néonatale 16, 7]. C'est pourquoi, en l'absence de consensus, le Collège national des gynécologues-obstétriciens français recommande la recherche d'un portage d'H. influencae au même titre que celui du streptocoque B ou d'E. coli, par la réalisation systématique d'un prélèvement vaginal chez toutes les femmes enceintes entre 35 et 37 semaines d'aménorrhée. En cas de présence d'H. influenzae, une antibiothérapie à visée éradicatrice est proposée par plusieurs auteurs [S-7]. Cependant cette attitude doit être validée par des études contrôlées.

Le traitement de ces bactériémies repose sur les céphalosporines de 3e génération ou sur l'association amoxicilline-acide clavulanique. En effet, si les souches non typables ont encore une sensibilité aux antibiotiques meilleure que celle des souches encapsulées, elles présentent néanmoins un phénotype sécréteur de b-lactamase en constante augmentation [1, 3].

CONCLUSION

Les infections gynéco-obstétricales à Haemophilus influenzae sont rares bien qu'en augmentation constante. Elles sont responsables chez la femme enceinte de bactériémies de pronostic maternofoetal redoutable. Un dépistage paraît justifié en cours de grossesse, suivi d'une éradication systématique en cas de colonisation par H. influenzae.

RÉFÉRENCES

1 Guérin JM, Verschoore-Beauchemin R. Infections à Harmophilus influenzae et apparentés chez l'adulte. Sem Hôp Paris 1997; 73: 101-13.
2 Dabernat H. Haemophilus influeuzae (CNR). Bulletin épidémiologique annuel. Epidémiologie des maladies infectieuses en France. Situation en 1997 et tendances évolutives récentes. Réseau National de Santé publique, Saint Maurice, France, avril 1999, p. 57-61.
3 Perdue DG, Bulkow LR, Gellin BG, Davidson M, Petersen KM, Singleton RJ, et al. Invasive Haemophilus influencue disease in Alaskan residents agod 10 years and older before and after infant vaccination programs. JAMA 2000; 283: 3089-94.
4 Quentin R, Musser JM, Mellouet M, Sizaret PY, Selander RK, Goudeau A. Typing of urogenital, maternal, and nconatal isolates of Haemophilus influeuzae and Haemophilus parainfluenzae in correlation with source of isolation and evidence for a genital specificity of H. influenzae biotype IV. J Clin Microb 1989; 27: 2286-94.
5 Schonheyder H, Ebbesen F, Grunnet N, Ejlersten T. Non-capsulated Haemophilus influenzae in the genital flora of pregnant and post-puerperal women. Scand J Dis 1991; 23: 1830-87.
6 Quentin R, Goudeau A, Burfin E, Pinon G, Berger C, Laugier J, Soutoul JH. Infections materno-foctales à Haemophilus influenzae. Presse Méd 1987; 16: 1181-4.
7 Rusin P, Adam RD, Petersen EA, Ryan K, Sinclair N, Weinstein L. Haemophilus influenzae: an important cause of maternal and neonatal infections. Obstet Gynecol 1991; 77: 92-6.