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1. morphologie classification

définition

Les bacilles gram négatif aéroanaérobies de culture facile sont :

des Bacilles ou un Coccobacilles Gram - souvent polymorphes, parfois incurvés

de culture facile sur géloses ordinaires

aéroanaérobie et de type fermentatif du glucose

réduisant en général les Nitrates en Nitrites

habituellement catalase + (mais la catalase n'étant pas recherchée on s'expose parfois à des surprises)

On distingue les différentes familles par différents caractères :

Familles :	Enterobacteriaceae	Vibrionaceae	Aeromonadaceae
Mobilité	négative ou péritriche (sauf Plesiomonas…)	négative ou polaire	négative ou polaire
Oxydase	négative (sauf Plesiomonas)	positive	positive
Genres	Liste des genres et espèces d'Entérobactéries en 2002 (Bergeys) en gras les genres et espèces fréquents en microbiologie médicale Alterococcus Arsenophonus Brenneria Buchnera Budvicia (aquatica) Buttiauxella (agrestis) Calymmatobacterium Cedecea (davisae,lapagei) Citrobacter (freundii, diversus, amalonaticus) Edwardsiella (tarda, hoshinae, ictaluri) Erwinia Enterobacter (aerogenes, cloacae, asburiae, agglomerans (voir Pantoea), gergoviae, sakazakii, taylorae, amnigenus, intermedium) Escherichia-Shigella (coli, fergusonii, hermanii, vulneris, blattae, Shigella) Ewingella (americana) Hafnia (alvei) Klebsiella (pneumoniae, oxytoca, planticola, terrigena) Kluyvera (ascorbata, cryocrescens) Leclercia (adecarboxylata) Leminorella (grimontii, richardii) Moellerella (wisconsensis) Morganella (morganii) Obesumbacterium (proteus) Pantoea (agglomerans) genre remplaçant Enterobacter agglomerans Pectobacterium Photorhabdus Plesiomonas (oxydase +) Pragia (fontium) Proteus (vulgaris, mirabilis, penneri, rettgeri, myxofaciens) Providencia (stuartii, alcalifaciens, rustigianii) Rahnella (aquatilis) Saccharobacter Salmonella (enterica) Serratia (marcescens, liquefaciens, rubidae, odorifera, plymuthica, ficaria) Sodalis Tatumella (ptyseos) Trabulsiella ex Koserella ? Wigglesworthia Xenorhabdus (luminescens, nematophilus) Yersinia (enterocolitica, frederiksenii, intermedia, kristensenii, pestis, pseudotuberculosis) Yokonella (regensburgei) (famille des Enterobacteriaceae, Ordre des Enterobacteriales (une seule famille), Classe des GammaProteae...)	genre Vibrio genre Listonella genre Photobacterium	genre Aeromonas

On prendra garde qu'une définition aussi précise ne peut que supporter des exceptions : le genre Plesiomonas va intégrer les Enterobacteries bien qu'oxydase + à ciliature polaire en raison de ses parentés génétiques avec Proteus ! N'oublions pas que les caractères phénotypiques sont limités et que 100 % en taxonomie cela n'a guère de sens.

Plesiomonas, parfois classé dans la famille des Vibrionaceae, est génétiquement très proche de Proteus, Entérobactérie, et doit, quoique il en coûte, y être placé. On ne peut définir une famille sans aucun regard (ou un regard limité) sur le DNA des bactéries ! Plesiomonas est donc une Entérobactérie.

Le génome de Vibrio cholerae est entièrement séquencé. Il contient 4 033 460 paires de bases (4 Mpb) réparties sur deux DNA circulaires (2,96 Mpb et 1,07 Mpb). Les gènes de virulence sont sur le premier, et 105 gènes sont en double, un exemplaire par chromosome. (Le Monde 4 août 2000)

Ymagier :

Vibrio

gram	microscopie électronique (MET)	Vibrio sur une cellule (MEB)

antigènes

Les antigènes portés par les Entérobactéries (et les autres ????), communs avec ceux d'autres bacilles gram - sont :

•  l'antigène O, composé d'un lipide A commun et toxique, d'une partie polyosidique commune à toutes les Entérobactéries (le core) sauf de rares mutants et d'une partie polyosidique apportant la spécificité des formes S.
•  les antigènes H, éventuellement sous deux phases (H1 et H2), de nature polypeptidique (flagelles)
•  les antigènes K ou Vi polyosidiques (capsule, microcapsule)
• d'autres Ag comme ceux des pili (fimbriae) de nature protéique

Ag O

Comme les autres bactéries gram - , la paroi des Entérobactéries est recouverte d'une membrane externe dont le feuillet externe est constitué du LPS

Certaines mutations affectent le core et/ou l'Ag O et on distingue:

• mutants R (Rough) = colonies rugueuses
• colonies S (Smooth)= colonies lisses ( bactéries non mutées, possédant l'Ag O)

La structure de l'Ag O est très variable d'une espèce à l'autre et au sein d'une même espèce, d'où le sérogroupage (E.coli, Salmonella)

Ag capsulaires

Certaines souches possèdent en plus une enveloppe polyosidique constituant une véritable capsule et donnant un aspect muqueux (colonies M : ex Klebsiella pneumoniae, certains E.coli). Ces souches présentent un Ag K qui masquent l'Ag O (on le détruit par chauffage 1 heure à 60 °C avant de rechercher l'Ag O).

Certaines Salmonella ( Typhi, Paratyphi C, rares Dublin ) possèdent des Ag de surface (Vi) polyosidiques de même nature que les AgK. Des phages les utilisent comme répcepteurs. Cet Antigène Vi est retrouvé aussi chez des Citrobacter.

Ag flagellaires H

Il existe des souches de Salmonella et d'autres Entérobactéries ( mobiles ! ) possédant un Ag H flagellaire, polypeptidique et souvent diphasique (2 gènes différents codent pour deux types de flagellines mais leur contrôle génétique fait que l'expression du gène est, pour un individu unique : dans la culture les deux types peuvent cohabiter).

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2. habitat

Entérobactéries

Les Entérobactéries sont présentes dans de nombreux éco-systèmes, en particulier l'intestin qui leur a donné son nom mais aussi dans l'environnement (eau, sol). Elles peuvent être saprophytes, commensales ou pathogènes. Le cas d'E. coli est typique puisque cette bactérie est retrouvée dans les eaux souvent en provenance d'une contamination fécale, dans l'intestin et certains E. coli sont pathogènes chez l'homme ou l'animal.

E. coli est utilisé en microbiologie alimentaire comme indicateur de contamination fécale : sa présence, en fonction de sa concentration, signe que des matières fécales ont été en contact avec l'aliment, donc

qu'il risque d'y avoir des agents pathogènes intestinaux non détectés ou non recherchés dans l'aliment (bactérie comme des Salmonella, nombreux entérovirus…)

que les conditions de préparation, de transformation ou de conditionnement de l'aliment ne sont pas réalisées dans de bonnes conditions d'hygiène : mains non lavées au sortir des toilettes par ex…

On prendra garde au fait que les dénombrements d'E. coli ne sont que des tests de contamination fécale et que ces E. coli ne sont pas considérés comme pathogènes (même s'ils le sont !).

Les coliformes ou les Entérobactéries sont aussi utilisés comme des tests de contamination fécale présumée.

Vibrionaceae et Aeromonadaceae

Les Vibrionaceae et les Aeromonadaceae sont des bactéries fréquentes dans les eaux (de rivière et de mer). Certaines sont halophiles (ne peuvent vivre qu'en présence de "sel"). En fait on trouve des halophiles se multipliant mieux en présence de sel mais capables de se multiplier dans les milieux hypotoniques, des halophiles "stricts" ne cultivant pas en milieux hypotoniques. L'élément indispensable est semble-t-il le sodium. Le degré de tolérance vis à vis de la concentration sodique dépend des souches). Vibrio cholerae est tolérante aux milieux hypotoniques tandis que Vibrio parahaemolyticus ne peut y cultiver.

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3. pouvoir pathogène

Le pouvoir pathogène des Entérobactéries concerne les syndromes digestifs, les infections du tractus urinaire, et une maladie très particulière, la PESTE. D'autres localisations sont possibles mais liées souvent à la dissémination des germes à partir du foyer initial.
N'oublions pas que des Entérobactéries sont phytopathogènes comme Pantoea (Enterobacter agglomerans)

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3.1. Syndromes digestifs

De nombreuses Entérobactéries sont capables d'infecter l'individu. Certaines sont toutefois plus pathogènes que d'autres :

• les Salmonella et particulièrement les Salmonella Typhi et paratyphiques
• les E. coli-Shigella
• Yersinia enterocolitica

Les divers modes d'action des bactéries entéropathogènes sont les suivants :

• la production d'une toxine cytotonique ou sécrétoire (cholera like) dans l'intestin déclenche les troubles car cette toxine se fixe sur les entérocytes ce qui provoque des modifications internes de la concentration de l'AMP cyclique (entérotoxine thermolabile de nature protéique) ou du GMP cyclique (entérotoxine thermostable de nature peptidique) provoquant des modifications de perméabilité ionique d'où la sortie d'eau et donc de la diarrhée.
• la production de cytotoxines (shigella-like ou non) provoque les lésions cellulaires. Il en existe évidemment de divers types :
  • des toxines de type perforine (comme la Streptolysine O ) ou des phospholipases (lécithinases) agissant sur la membrane plasmique ou les membranes internes.
  • des toxines interférant avec le métabolisme (inihibition de la synthèse des protéines par ex.) comme les toxines Shigella-like ou vérotoxines
  • des toxines provoquant des modifications du cytosquelette et pouvant provoquer ainsi un relâchement des jonctions serrées et la diarrhée.
• la bactérie est capable d'envahir les cellules et de s'y multiplier (virulence ) donc dispose de moyens lui permettant de s'opposer à la phagocytose-digestion :
  • empèche l'union lysosome-phagosome
  • détruit la membrane du phagosome
  • s'oppose aux enzymes lysosomiales en particulier aux peroxydes
• la bactérie est capable d'envahir la muqueuse (tissus) et de s'y multiplier (virulence) avec passage intracellulaire ou non
• la bactérie est capable de disséminer au delà des tissus locaux (vers le sang ou la lymphe)

On prendra garde que ces différents facteurs de virulence bactériens sont fonction de l'hôte.

De plus, ces différents facteurs de virulence sont exprimés à des degrés forts variables chez les différentes bactéries, sans être toujours bien connus, et peuvent atteindre des lieux variés du tube digestif (intestin grêle (duodénum, iléon, jéjunum), gros intestin). De plus la réaction dépend de l'hôte.
Quelques exemples :

Salmonella Typhi est d'abord à multiplication intracellulaire suivie éventuellement d'une invasion lymphatique. Elle passe probablement par les cellules M de l'épithélium, cellules assurant le transfert au système immunitaire (macrophages et cellules dentritiques). La typhoïde, spécifiquement humaine, est la salmonellose la plus grave avec 17 mllions de malades par an dans le monde, 600 000 morts (80 % d'enfants de moins de 5 ans). En France, les cas sont rarissimes (une épidémie de 5 cas en 2003) et les cas sont essentiellement d'importation.

Shigella dysenteriae, les EIEC (Entéro-invasifs) sont d'abord à multiplication intracellulaire et toxinogènes (vérotoxine).

Les EPEC agissent essentiellement par "effacement" des microvillosités par une toxine altérant le cytosquelette cellulaire.

Les ETEC libèrent des entérotoxines cytotoniques

Les EHEC (entérohémorragiques) libèrent une quantité importante de cytotoxines dans le gros intestin probablement et peuvent être invasifs (peut être seulement chez certains individus). Ils libèrent aussi une toxine agissant sur le cytosquelette.

Yersinia enterocolitica et pseudotuberculosis envahissent la muqueuse intestinale près de la fin du grèle.

Cas du Choléra et des ETEC :

C'est essentiellement le choléra qui pose problème ce qui n'exclut pas l'intervention d'autres Vibrionaceae ou Aeromonadaceae dans différents syndromes opportunistes. On peut en particulier noter le rôle de Vibrio parahaemolyticus dans quelques intoxications alimentaires liées à la consommation de produits de la mer très rares en France. Le choléra est une maladie redoutable caractérisée par une diarrhée afécale (en eau de riz) qui peut être extrêmement importante (10 litres par heure ) et va entraîner la mort par déshydratation. De nombreux cas sont asymptomatiques ou avec une diarrhée légère (de 4/5 pour V. cholerae cholerae à 1/40 pour Vibrio cholerae El tor).

Le choléra est essentiellement du à une toxine protéique qui se fixe sur l'entérocyte, provoque une augmentation de l'AMPc intracellulaire ce qui conduit à des modifications de la perméabilité aux Chlorures qui sont excrétés de la cellule et entraînent la perte sodée et liquidienne.
(voir toxines cytotoniques)

La bactérie, découverte par Koch en 1883, ne se multiplie que dans la lumière de l'intestin : elle n'est pas invasive (au sens de pénétration dans l'individu proprement dit comme au sens d'invasion intracellulaire).

Le vibrio cholérique appartient au sérotype O1. Il existe deux biovars, classique et El tor. On peut distinguer trois variétés antigéniques plus ou moins claires (Inaba, Ogawa et discutée Hikojima).

Un nouveau Vibrio de sérotype O139 est apparu en 1993 dans le sous-continent indien. Il semble redoutable et très épidémique mais n'a pas disséminé au delà. Il résulte probablement d'échanges génétiques entre Vibrio. Il existe en effet 150 sérovars de V. cholerae.

La pandémie actuelle a débuté en 1961 en Indonésie et s'est répandue dans le monde entier, essentiellement fixée dans les pays pauvres d'hygiène fécale défaillante et chauds :

• Amérique latine (sauf Argentine, Paraguay, Uruguay et Guyanes
• Afrique noire y compris Madagascar.
• Iraq, Iran, Afghanistan, Inde, Viet-Nam, Cambodge...

État mondial du Choléra

Épidémie actuelle (Vibrio eltor)

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3.2. Syndromes urinaires

E. coli est le pathogène le plus important au niveau du tractus urinaire. Il s'agit de certains sérovars O très particuliers ( O1, O2, O4, O6, O17, O18, O22, O75) qui sont en cause, les UPEC (uropathogènes). Ils gagnent le rein par la voie ascendante en remontant l'urêtre. Ce sont probablement des hôtes normaux de la flore commensale de l'individu qui sont en cause. Il existe très certainement une sensibilité individuelle particulière.

D'autres bactéries sont mises en cause dans ces infections du tractus urinaire, souvent à la suite de manipulations de type sondage chez des patients malades.

Les EHEC peuvent déclencher un syndrome hémorragique et urémique par action de la toxine sur les cellules rénales chez les individus sensibles.

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3.3. La peste

C'est Yersinia pestis qui est la cause de la peste, maladie redoutable et toujours possible car de nombreux foyers persistent dans le Monde, en particulier à Madagascar ou aux USA mais aussi en Algérie de façon sporadique.
Yersin isola la bactérie de cadavres de pesteux en 1894 et Simond mis en évidence le rôle de la puce comme vecteur. Le rôle de réservoir des rats paraissait évident par la mortalité affectant ces animaux avant l'épidémie humaine. La peste est une anthropozoonose.

Trois grandes pandémies durant l'histoire :

• le foyer "initial" semble égyptien vers -1400 AJC avec la transmission de la bactérie du rat du Nil au rat noir arrivant d'Asie, par l'intermédiaire de leurs puces (voir La Recherche 374 avril 2004)
• peste de Justinien au VI^e siècle qui a sévi dans tout le bassin méditerranéen.
• peste noire de 1347 à 1352 (et persistance en Europe jusqu'en 1845) qui a décimé les populations européennes de façon massive (entre 33 et 50 % des habitants). Par PCR on a pu montrer qu'un gène spécifique de Y. pestis était présent dans des cadavres d'un charnier de Montpellier datant du XIVe siècle, validant ainsi l'origine pesteuse de la peste noire (voir La Recherche 228 jan 2001).
• Hong Kong 1894 où Yersin isola la bactérie et l'étudi

Une petite épidémie tue 30 personnes en région parisienne en 1920 (chiffonniers de Saint Ouen) et quelques cas en 1945 en Corse.

La maladie présente deux aspects possibles :

• la peste bubonique : les bacilles sont injectés ou déposés par une puce vectrice. Ils se multiplient sans bruit durant un à sept jours puis la maladie se déclare de façon foudroyante, avec une forte fièvre, des vomissements. On observe un bubon, gros ganglion lymphatique de la zone de la piqûre. L'infection se généralise par septicémie très rapidement. Mortalité 70 % en absence de traitement.
• la peste pulmonaire, causée par une contamination par voie aérienne déclenchant une pneumonie mortelle en absence de traitement en moins de 4 jours et qui est très contagieuse.

Attention : la peste noire ne se traduit pas par des cadavres noirs... Pestis atra signifie en latinmort horrible (voir "Pas vite et reviens tard" de Fred Vargas, intéressant roman sur la peste de 1920. (éditions Vivane Hamy)

Lire "évidemment" La peste d'Albert CAMUS.
Voir : http://www.insecta-inspecta.com/fleas/bdeath/Black.htm
http://www.bium.univ-paris5.fr/histmed/medica/peste.htm

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4. isolement

Les bacilles gram négatifs aéroanaérobies de culture facile cultivent sur tous les milieux sans inhibiteurs habituels en aérobiose et anaérobiose (GO, GTS, CLED, Gélose au sang, Gélose chocolat enrichie...).

L'isolement polyvalent sélectif utilise le milieu de Drigalki ou EMB. Les agents sélectifs utilisés sont le désoxycholate (pratiquement dans tous les milieux sélectifs des Entérobactéries), le cristal violet, le vert brillant...

Pour rechercher les Salmonella des milieux facilitent la recherche des colonies pouvant en être : on utilisera par exemple Hektoen, SS, Rambach agar ... Les caractères utilisés sont la non-utilisation du lactose, du saccharose et de la salicine ainsi que la production éventuelle d'H₂S (Salmonella seulement). On ne peut en aucun cas affirmer que les milieux utilisés "favorisent" les Salmonella : toutes les bacilles gram - risquent d'y cultiver (sauf cas particuliers) mais peuvent donner des aspects différents de celui des Salmonella ou Shigella. Le cas du milieu Hektoen est particulièrement intéressant : il a été inventé pour éliminer les Proteus vulgaris saccharose + de l'analyse ultérieure mais les Pseudomonas y cultivent (donnant des colonies vertes ou bleues) comme les E. coli (donnant des colonies éliminées puisque saumon). Une enrichissement en Salmonella est possible.

La recherche spécifique de Yersinia utilise le milieu Yersinia-CIN. Les Yersinia utilisent le mannitol du milieu.

La recherche des Vibrio cholerae utilise un enrichissement, particulièrement en cas de recherche chez le porteur sain. Il est réalisé en eau peptonée salée (30 g.dm^-3) alcaline (pH 8,8 environ). La durée de l'incubation doit être courte. L'isolement peut être réalisé sur gélose TCBS (thiosulfate, fer III, citrate, bile, saccharose, BBT et BT, pH 8,6) directement ou à partir de la surface de l'eau peptonée alcaline d'enrichissement. Les colonies suspectes sont H₂S -, saccharose + et oxydase +

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5. identification

Les bacilles gram négatifs aéroanaérobies de culture facile sont identifiés essentiellement par des microméthodes, inventées avec la galerie API20E dans les années 1970 pour identifier de nombreuses Entérobactéries pathogènes opportunistes. Ce sont :

• la galerie API20E, Rapid20E et ID 32 E, et pour les Non entérobactéries la galerie API20NE.
• l'Enterotube II
• des microméthodes automatisées (Vitek, Microscan...)

Galerie conseillée :

GO pour le réisolement (ATTENTION : à condition que le milieu d'origine soit ordinaire)

VF ou/et Hugh et Leifson glucosés (pouvant être avantageusement remplacés par Kligler...)

Kligler (pour le sérotypage et la vérification du caractère lactose)

API20E ou équivalent (y compris pour les Vibrio-Aeromonas pour lesquels API20NE doit être préférée)

En cas d'orientation vers Aeromonas ou Vibrio, la recherche de la sensibilité à O129, composé vibriostatique, (2,5 diamino 6,7 di-isopropylptéridine) qui inhibe Vibrio en général mais non Aeromonas (diamètre critique de 15 mm sur gélose ensemencée en nappe avec un disque de 500µg). Cette technique n'est guère utile si une galerie biochimique complète est utilisée :

Le sérogroupage est applicable au genre Salmonella, Shigella, Yersinia enterolitica et pour les E. coli entéropathogènes des nourrissons (bien discutable!). Il l'est aussi pour Vibrio cholerae :

• le sérotypage
  
  

La recherche des toxines se fait dans certains laboratoires hospitaliers. Il existe des techniques de dosage de la toxine (essai sur des cellules en culture, particules de latex sensibilisées par des anticorps anti TC, Elisa ) ou de mise en évidence du gène codant pour la toxine (ctx) par sonde moléculaire clonée chez E. coli agissant sur les fragments de restriction de l'ADN de la bactérie testée

Dans le cas de la peste, un test récent permet la détection d'un antigène F1 spécifique dans tout prélèvement, y compris chez les rongeurs. Le test est immunochromatographique (voir Opéron n°26). Il est utilisable en "brousse" très facilement.

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6. traitement et antibiogramme

Le traitement des diarrhées est souvent symptomatique : la diarrhée est avant tout un moyen de défense de l'individu qui élimine ainsi le pathogène. Le grand danger est la déshydratation qui doit être compensée. La réhydratation du malade utilise

la voie veineuse avec un liquide de Ringer au lactate (soluté isotonique riche en hydrogénocarbonate et potassium).

la voie orale, si elle est possible (absence d'importants vomisements) avec un sel de réhydradation orale OMS/UNICEF de composition suivante pour 1 L :

• glucose 20 g
• NaCl 3,5 g
• KCl 1,5 g
• Citrate disodique anhydre 2,9 g ou hydrogénocarbonate de sodium 2,5 g

  (osmolarité 311 mosm/L)

En cas de fièvre et d'invasion, l'antibiothérapie sera très sûrement nécessaire.
Les Gram - sont constamment résistants à la Pénicilline G qui ne peut pas pénétrer. Ils sont par contre le plus souvent sensibles à l'ampicilline, molécule résultant d'une modification simple de la pénicilline G.

Quelques particularités peuvent être notées chez les Entérobactéries :

• Proteus-Providencia-Morganella : résistent à la colistine et aux polymyxines
• Klebsiella résiste à la carbénicilline
• Serratia présente un aspect particulier avec la Colistine (cocarde)
  

C'est chez les Entérobactéries que les transferts de plasmides porteurs de la résistance à de multiples antibiotiques ont été mis en évidence. La découverte au Japon de Shigella multirésistantes chez un malade a conduit les chercheurs à trouver des E. coli commensaux qui avaient les mêmes résistances : ils ont pu ainsi montrer que la bactérie commensale avait transmis à la pathogène les gènes de résistance par l'intermédiaire d'un plasmide.

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7. prophylaxie

La lutte contre les maladies d'origine digestive met en jeu :

• l'hygiène et en particulier la lutte contre le péril fécal
• le traitement des malades
• la vaccination :
  • Pour le choléra : Le vaccin classique (bacilles tués injectés) est d'intérêt douteux et actuellement abandonné. Des vaccins nouveaux ont été recherchés :
    • un vaccin vivant oral obtenu par génie génétique n'a pas donné de bons résultats. (avec risque de réversion)
    • l'anatoxine préparée s'est révélée inefficace sur le terrain.
    • des extraits de V. cholerae (toxines, cellules entières tuées) par voie orale, à l'heure actuelle en test, sont probablement généralisables.
      Voir : le Choléra dans tous ses aspects (en particulier revue des vaccins)
      
      
  • Pour les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes, le classique TAB, utilisé contre S. Typhi, ParaA et ParaB a été abandonné en raison de son efficacité limitée et des fortes réactions qu'il suscitait. Il est remplacé, contre Salmonella Typhi seulement par l'antigène polyosidiqueVi purifié, vaccin coûteux et efficace.

La lutte contre la peste c'est d'abord la lutte contre le rat donc une amélioration des conditions d'hygiène. Le vaccin existant est peu efficace. Une prophylaxie par antibiotiques est possible.

compléments

dfgdf

article prévisionnel sur les E. coli pathogènes

Épidémie de shigellose par baignade (BEH)