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[ qu'est ce que les anaérobies strictes | méthodes d'étude | anaérobiose | isolement | état frais | culture | identification | systématique | clostridium (flore tellurique) | botulisme | tétanos | | myonécroses à C. perfringens | clostridium difficile | TIAC à Clostridium perfringens | flore deVeillon | compléments ]
FADH2 + O2 --> FAD + H2O2
Il semble aussi que la dernière réaction de la respiration, la réduction de l'Oxygène, donne dans un premier temps des ions superoxydes :
e- + O2 --> O2.-
2H+ + 2 O2.- --> H2O2 + O2
D'ailleurs ces peroxydes sont utilisés par le macrophage notamment pour tuer les cellules étrangères.
Les êtres vivants qui ne possèdent pas ces enzymes meurent en présence d'oxygène et sont donc anaérobies strictes. Ceux qui en possèdent peu ou seulement des peroxydases cultivent préférentiellement en anaérobiose (Streptococcus, Lactobacillus).
Cette interprétation est une approche classique qui sera un jour éclairée par d'autres données : il existe en effet des anaérobies strictes catalase positive !
Certaines bactéries sont mêmes EOS (Extremement Oxygen sensible) : elles ne peuvent survivre, même brièvement, en présence d'une faible concentration de dioxygène. Ces EOS sont très nombreuses dans la flore fécale et appartiennent souvent aux Archébactéries.
Le but fondamental est d'éliminer l'oxygène.
Mais il faut de plus éviter qu'il ne revienne : le conditionnement est donc essentiel avec :
- des tubes à section étroite
- des milieux gélosés où l'oxygène diffuse mal
- des milieux sous paraffine ou vaseline
- des enceintes hermétiques ou jarres ou des hottes anaérobies.
C'est le procédé de dégazage le plus simple : l'ébullition assure par diminution de la solubilité des gaz avec l'augmentation de la température, le départ de l'oxygène (et des autres gaz de l'air).
Des molécules peuvent être ajoutées dans le milieu en assurant une certaine anaérobiose. On les utilise donc en combinaison avec d'autres méthodes comme la régénération. Ces molécules ne doivent pas être toxiques pour les micro-organismes. On utilise la CYSTÉINE ou des morceaux d'organes contenant de la CYSTÉINE (Cervelle, rein, foie...).
En effet la cystéine est réductrice : deux molécules de cystéines s'unissent par un pont disulfure en libérant deux électrons.
On utilise aussi le thioglycolate de sodium (retrouvé dans les milieux pour hémocultures) appelé aussi acide mercaptoéthanoïque de formule HS-CH2-COOH.
La génération de l'hydrogène est obtenue par réaction d'ions H+ de l'eau sur l'hydrure (sous forme de borohydrure) :
BH4- --> BH3 + H- (ion hydrure : un proton entouré de deux électrons donc chargé -) ou
H- + H+ --> H2
L'hydrogène réagit avec l'oxygène en présence d'un catalyseur afin d'éviter l'explosion pour donner de l'eau.
2 H2 + O2 --> 2 H2 O
En règle générale, un dégagement de dioxyde de carbone est réalisé en même temps car il favorise la culture de ces bactéries.
Les systèmes commercialisés comme GasPack®, sont formés d'un sachet contenant deux comprimés contenant l'un le borohydrure de sodium et de l'acide citrique, le deuxième de l'hydrogénocarbonate de sodium et de l'acide citrique comme dans les comprimés effervescents. L'addition d'eau permet la réaction et impose le placement rapide du sachet dans la jarre et sa fermeture. Il convient d'éviter une flamme proche à cause du dihydrogène.
Le système Generbag Mérieux permet d'obtenir l'anaérobiose par simple ouverture d'un sachet dont la composition n'est pas connue mais qui comprend un réducteur de l'atmosphère et un générateur de dioxyde de carbone.
Merck commercialise un système analogue à base de fer comme réducteur.
L'air est éliminé par des gaz purs : azote par ex.
Des milieux sont conditionnés sous azote comme le milieu pour la galerie API20A.
Les enceintes anaérobies sont de même sous une atmosphère artificielle.
Il existe des molécules permettant de "mesurer" le niveau de l'naaérobiose, le rH2. Ce sont des colorants existants sous deux formes selon létat rédox du milieu, des indicateurs rédox. Un des plus connus c'est le bleu de méthylène qui est bleu en présence de dioxygène et blanc en milieu réduit.
isolement en profondeur (technique ancienne)
On utilise une série de géloses VF sans recharger entre elles et sans stériliser la pipette. Il faut 6 géloes pour une souche pure et 12 pour un mélange. On préfère aujourd'hui d'autres techniques mais la conservation des souches est ainsi très efficace sans précautions particulières. La récupération des bactéries impose de casser stérilement le tube. L'opération est délicate (voir Dictionnaire des techniques, fiche Isolement pages 120)
isolement en surface (technique à utiliser aujourd'hui)
L'isolement se fera sur milieux riches comme la gélose au SANG frais ou la GC + PV.
Il devra être incubé en anaérobiose en jarre.isolement sélectif en surface
Des antibiotiques permettent d'assurer une sélectivité à l'isolement :
ex : Kanamycine + Vancomycine pour l'isolement des bacilles gram négatif du genre Bacteroides.Pour les bactéries sporulées, on peut facilement éliminer les formes végétatives et les autres bactéries par chauffage 10 minutes à 80°C.
Une effilure de pipette Pasteur recueille un peu de bouillon étuvé. On coupe cette pipette et on la place sur une lame. On obture les extrémités avec de la paraffine fondue. Cette technique ancienne n'est pas facile à mettre en oeuvre dans des conditions de sécurité optimales.
Certains auteurs préconisent l'état frais luté tel qu'il était réalisé antan pour toutes les bactéries. Or le lutage risque de provoquer la formation d'aérosols, chauffe la lame, prend du temps : la mobilité sera beaucoup plus facile à détecter sur un état frais classique (bouillon anaérobie) pourvu qu'il soit observé très rapidement.
Ce sont des bactéries exigeantes : l'apport de facteurs de croissance est nécessaire en particulier l'hémine ou la vitamine K1 pour certains germes. Le sang (ou le sang laqué) est donc un bon candidat pour l'enrichissement, d'autant qu'il apporte la catalase.
L'apport de substances réductrices est utile (cystéine, thioglycolate...) au maintien de l'anaérobiose.
milieu de Schaedler :
- peptones et extrait de levure
- glucose
- tampon TRIS
- hémine
- Chlorhydrate de L-Cystéine
- Vitamine K3
milieu TGY (trypticase-Glucose-Yeast)
- peptones et extrait de levure
- glucose
- thioglycolate de sodium (réducteur)
milieu VF (viande foie)
milieu VL (viande levure)
bouillon de Schaedler
bouillon VF ou VL
milieu de Rosenow :
- peptones
- chlorhydrate de cystéine
- glucose
- chlorure de sodium
- indicateur d'Andrade (fuchsine acide)
- marbre blanc (carbonate de calcium neutralisant les ions acide)
- morceau de cervelle
La lecture de ce milieu est très empirique : gaz visible par décollement du bouchon de paraffine, fermentation du glucose (virage au rouge), réduction du milieu (virage au vert et à l'incolore).
gélose au sang frais (base : Columbia, Schaedler...)
gélose VF qui reste le miielu de choix pour la conservation des anaérobies strictes.
milieu TSC (Tryptone-Sulfite-Cyclo-sérine) Ce milieu est utilisé pour l'isolement de Clostridium perfringens des eaux.
- tryptone
- citrate de fer ammoniacal
- disulfite de sodium (générateur de sulfite)
- cyclosérine (antibiotique)
- agar-eau
milieu de Willis
- base columbia
- lactose
- rouge neutre
- émulsion de jaune d'oeuf
- (éventuellement : néomycine pour inhiber les Entérobactéries)
On peut étaler sur une demi-boîte du sérum anti Cl. perfringens pour inhiber l'action enzymatique.
La galerie API20A est calquée sur la galerie API20E mais l'inoculation est faite avec un bouillon de Schaedler (additionné de tryptophane) fortement ensemencé et conditionné sous azote. L'incubation est anaérobie.
On recherche la fermentation
- de nombreux glucides (indicateur de pH : BCP)
- l'Uréase,
- la production d'indole
- l'hydrolyse de l'Esculine avec un problème de distinction entre H2S et Esculine que la fluorescence de l'Esculine sous UV permet de résoudre.
- la gélatinase.
Cette galerie est basée sur un inoculum important et une incubation courte et AÉROBIE.
Les recherches sont donc essentiellement enzymatiques :
Uréase, ADH,diholosidases, Arylamidases, etc…
La chromatographie en phase gazeuse est utilisée de deux façons en microbiologie et trouve une application particulièrement importante pour les anaérobies :
- identification et dosage des produits de fermentations
- identification et dosage des produits volatils (AG en général) de la cellules entière.
Les profils obtenus, dans des conditions qui doivent être parfaitement standardisées, conduisent à l'identification par comparaison avec des profils standards établis par ailleurs.
Des difficultés techniques et la nécessité d'une base de données importante, ralentissent considérablement l'utilisation de cette technique ancienne en routine.Ex : CPG de Clostridium difficile :
Depuis de nombreuses années, bioMérieux commercialise une technique approchant l'identification des anaérobies en utilisant des inhibiteurs par la méthode des disques. Ce sont :
N'oublions pas qu'il faut ABSOLUMENT VÉRIFIER QUE LA SOUCHE EST ANAÉROBIE STRICTE AVANT d'identifier. La technique la plus fiable est l'absence de culture sur gélose au sang frais anaérobie.
La taxonomie des anaérobies strictes n'est pas aussi évidente qu'il n'y paraît. En effet, une bactérie cultivant habituellement en aérobiose peut devenir anaérobie stricte par perte de gènes essentiels à la vie aérobie. Il n'est donc pas surprenant de trouver des Streptococcus ou des Lactobacillus anaérobies strictes ! Nous avons pu ainsi trouver un Lactobacillus identifié comme acidophilus (en API20A) dans une selle normale... trouvant là une source possible pour la flore vaginale !
L'habitude est de distinguer les sporulés sous la dénomination de "flore tellurique" des autrs anaérobies strictes. On verra que le qualificatif de tellurique est très certainement faux.
Les Clostridium sont des bacilles anaérobies strictes et sporulés.
On parle de flore tellurique c'est à dire du sol. Cette dénomination ne signifie pas que les Clostridium soient des hôtes normaux du sol... En effet les Clostridium sont des hôtes des matières fécales et les retrouver dans le sol peut être dû à la contamination fécale bien plus qu'au saprophytisme !
historique Bactériologie médicale (Flammarion)
Le botulisme est une intoxination alimentaire, c'est à dire une maladie due à l'ingestion d'une toxine dans les aliments.
Cette maladie est redoutable car mortelle car la toxine bloque la transmission des PA du neurone au muscle déclenchant une paralysie.
La toxine est thermolabile.
Les conditions de la production de toxine par C. botulinum sont : anaérobiose, concurrence limitée par d'autres bactéries, absence de nitrites, pH neutre à alcalin. Deux produits sont concernés : les conserves mal stérilisées et les jambons crus (le bacille passe de l'intestin du porc à la viande probablement)
Il existe 6 à 7 types immunologiquement différents de toxines.
Il s'agit essentiellement d'une expertise soit à partir de l'aliment, soit à partir d'un prélèvement du malade ou du cadavre. On peut rechercher la bactérie, mais on recherche plutôt la toxine par toxinotypie.
La toxinotypie est l'identification d'une toxine par des techniques immunologiques.
Le principe de base est de tester une dilution du produit sur un animal en ajoutant des solutions d'Ac neutralisatrices de types différents de toxine (A à F)
La technique peut être la suivante :
1°/ broyat du produit suspect et filtration
2°/ répartition du filtrat et adjonction des sérums connus. On conserve deux témoins, l'un est laissé tel quel (positif), l'autre est chauffé (négatif)
3°/ Injection d'un aliquote de chaque tube à un lot d'animaux (souris, cobaye)
4°/ Bilan des survivants.
Identification d'une toxine botulinique dans un aliment (Travaux de Mr Sebald)
Ex de résultats :
- toxine ou toxique thermolabile différent de la toxine botulinique OU
- toxine trop concentrée (diluer le filtrat)
- deux toxines botuliniques ensemble.
guerre bactériologique : l'assassinat d'un dignitaire nazi (Médecine et maladies infectieuses)
Botulisme en Italie (olives)
Le tétanos est une intoxination suivant une infection limitée par Clostridium tetani à la suite de son introduction accidentelle dans l'individu. (ancien nom : Plectridium tetani)
Cette pénétration est particulièrement redoutée devant des plaies contaminées par de la terre, du crottin de cheval... mais peut survenir après des soins dentaires, des brûlures, des opérations abdominales... montrant que des bacilles commensaux peuvent être à l'origine d'un tétanos.
Cette maladie est redoutable car souvent mortelle : la toxine bloque la transmission des potentiels d'action dans le système nerveux central conduisant à des contractions ininterrompues des muscles.
Il existe un seul type immunologique de la toxine.
Les Clostridium perfringens peuvent provoquer des infections sous-cutanées mais sont surtout redoutés dans l'attaque du muscle : la myonécrose. Le caractère très gazogène de cette bactérie et l'altération profonde des tissus provoquée ont nommé cette affection gangrène gazeuse. L'action destructrice du Clostridium est redoutable et peut conduire à une mort d'autant plus rapide qu'il libère des toxines.L'origine de la bactérie est - soit la flore commensale - soit la flore tellurique (accident, guerres) mais souvent à partir d'une contamination fécale du sol.
Un traumatisme est nécessaire :
L'action de la bactérie est si puissante (enzymes, toxines...) qu'il est parfois impossible de faire quoi que ce soit ... La mort survient alors en moins de 24 heures
Clostridium perfringens est une bactérie immobile et capsulée (particulièrement dans les produits pathologiques). Tous les C. perfringens élaborent une toxine a qui est une phospholipase de type C (lécithine donne diglycéride + phosphoryl choline). (M = 50 kg/mol) mais à des degrés divers. Le Clostridium perfringens de type A, principal agent pathogène chez l'homme, est le plus grand producteur. Cette phospholipase provoque hémolyse et lécithinase sur gélose au jaune d'oeuf. Elle est neutralisée par un sérum correspondant. l'hémolyse peut présenter deux zones :
- une zone d'hémolyse nette étroite
- une zone d'hémolyse floue importante autour de la précédente.
Clostridium perfringens produit de l'hydrogène sulfuré d'odeur caractéristique à partir des acides aminés soufrés ou à partir de substrats minéraux comme les sulfites.Il fermente le lactose. (voir milieu de Willis)
Clostridium difficile est retrouvé dans les matières fécales de plus de 70% des nouveaux nés, et 3% des individus adultes réalisent un portage sain au niveau des intestins, colon et rectum essentiellement. L'administration d'antibiotiques peut rompre l'équilibre de la flore intestinale et conduire au développement de Clostridium difficile qui n'est plus en compétition avec d'autres germes. Il provoque une inflammation du colon, une diarrhée aqueuse et muqueuse très abondante et éventuellement une colite pseudomembraneuse pouvant être mortelle (20 % des diarrhées post-antibiothérapie). Ce sont de fausses membranes, contituées de débris cellulaires et de fibrine qui justifient le nom.
Des toxines sont en cause :
- entérotoxine : nécrose des cellules épithéliales de l'intestin et hémorragies intestinales (Pr de M = 500 kg mol -1)
- cytotoxine : effet cytotoxique : arrêt de multiplication cellulaire, arrondissement par destruction du réseau d'actine par l'intermédiaire de l'inactivation de la protéine rho, détachement du support. (Pr de M = 250 kg mol -1)
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L'isolement est possible même s'il est délicat et la mise en évidence des toxines est indispensable pour mettre en cause la souche isolée.
La détection de C.difficile peut se faire sur la souche ou sur les selles suspectes. Elle se fait par la mise en évidence de l'action des toxines A et B. On ajoute à des cultures cellulaires un filtrat stérilisé par filtration de selles suspectes de contenir C.difficile (et donc les toxines excrétées) : l'effet cytopathogène (lyse des cellules en culture) est observé. Parallèlement on réalise sur une autre culture une inactivation des toxines par des immunsérums dirigés contre ces toxines.
Elle est liée à l'absorption d'un aliment fortement contaminé par des spores qui n'ont pas été détruites par le procédé de réchauffage utilisé et aliment qui a été conservé dans de mauvaises conditions d'hygiène ou surtout mal cuit. Il faut plus de 106 bactéries vivantes par g pour déclencher l'intoxication.
Les bactéries sous forme végétative et les toxines sont détruites dans l'estomac. Les spores ingérées passsent dans l'intestin où elles germent. Les formes végétatives de ces souches particulières entrent très rapidement en sporulation et produisent une entérotoxine (cristal protéique parasporal ?, enveloppe sporale excrétée en quantité excessive ?) qui provoque les troubles.
La maladie est courte et sans gravité.
Les autres anaérobies strictes sont essentiellement des commensales pouvant devenir pathogènes à l'occasion d'une déficience du terrain. Elles provoquent souvent des infections en association avec des bactéries aérobies.
Classification :
| Bacilles gram + non sporulés: | bacilles réguliers ± allongés : Eubacterium, Lactobacillus bacilles corynémorphes : |
| Coques gram + | Peptostreptococcus bactéries le plus souvent très proches de Streptococcus |
| Bacilles gram négatif | Bacteroidaceae : Bacteroides, Fusobacterium etc |
| Coques gram négatifs : | Veillonaceae |
| Spirochètes : | Treponema anaérobies strictes comme T. vincentii |
Bacilles à Gram négatif
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| I Bacteroides du groupe fragilis |
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| II genre Prevotella |
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| III genre Porphyromonas |
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| IV Bacteroides autres que fragilis |
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| V genre Fusobacterium |
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Deux exemples d'infections classiques :
l'angine de Vincent.
Cette angine ulcréonécrotique associe Fusobacterium et Treponema (ou Borrelia) vincentii. Elle se traduit en particulier par une odeur particulièrement forte et pestilentielle. On traite par la pénicilline G.
Infections abdominales
On trouve souvent Bacteroides fragilis, en association avec Escherichia coli dans des infections d'origine digestive.
Les nombreuses études menées sur les anaérobiestrictes apportent de profonds changements. Mais le plus important est de s'affranchir de la division liée au type respiratoire et donc de reconnaître que des bactéries peuvent appartenir au même groupe, qu'elles soient anaérobies strictes ou non. C'est en particuler le cas pour Lactobacillus et Streptococcus.
Ce texte a été écrit par Jean Noël Joffin qui souhaite que vous lui transmettiez vos critiques. Merci.
